ISOLASI DNA
A. ABSTRAK
Isolasi DNA adalah teknik esensial dalam biologi molekuler. Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen. tujuan isolasi DNA adlah mengenal dan mempraktekkan teknik dalam melakukan isolasi DNA dari tanaman dan DNA jaringan / sel hewan. Metode yang digunakan meliputi lisis sel, pemisahan protein dan kontaminan lainnya,, presipitasi DNA dan penentuan konsentrasi DNA, pemurnian dan pemanenan DNA. Hasil dari isolasi DNA dari 3 kelompok isolasi DNA tanaman dan 3 DNA hewan ada satu yang terlihat bagus, dan mendekati murni. Yaitu pada kelompok 6, karena hanya memiliki basepair ( pasangan basa ) atau satu garis. Kesimpulan : teknik yang digunakan dalam isolasi DNA tanaman dan hewan tidak jauh berbeda. Perbedaannya terletak pada perlakuannya. Dan keberadaan dinding sel pada tanaman, sedangkan pada hewan tidak memiliki dinding sel.
Kata kunci : Isolasi DNA, DNA sequence, metode isolasi DNA.
B. PENDAHULUAN
1. Latar belakang
Percobaan isolasi DNA tanaman dan hewan perlu dilakukan karena isolasi DNA sendiri merupakan teknik esensial dalam biologi molekuler. Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen ( Surzycki, 1936 ).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. ( Surzycki, 1936 ). Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA.
Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen ( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma. ( Elrod, 2007 ).
Terdapat organel-organel bermembran ganda pada dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA dari tanaman dan hewan untuk mengetahui DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Dan Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak ,lengkap dengan komponen-komponen lain.DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleus yang terbungkus membran ( Albert, 1994 )
2. Tujuan
Ø Tujuan isolasi DNA tanaman adalah mengenal dan mempraktekkan teknik dalam melakukan isolasi DNA dari tanaman
Ø Tujuan isolasi DNA hewan adalah mengenal dan mempraktekkan teknik dalam melakukan isolasi DNA dari jaringan atau sel hewan
C. 2,5 ml N cair daun
METODE KERJA
1. Dipanaskan 65°,15-30`
Isolasi DNA tanaman
Buffer ekstraksi
Bayam m
800µl chlorofom
Diinkubasi 65°, 60`
2. Isolasi DNA hewan
Sampel darah eppendorf eppendorf
PBS 1000 µl
supernatan di buang
sentrifuge ependorf
PBS 1000 µl
eppendorf supernatan di buang eppendorf
supernatan di buang eppendorf Sentrifuge
SDS 15 µl mikroliter proteinase K
NTE 1000µl
eppendorf eppendorf ependorf inkubasi 24 jam
Shaking Larutan phenol eppendorf
CIAA sentrifuge
CIAA
supernatan di buang
homogenasi
ependorf
Berulang-ulang sampai interphase supernatan diambil
Sentrifuge 
ependorf
ethanol 1/20 volume 3 M Na asetat
ependorf
Presipitasi 10-15’ DNA presipitat diambil
Simpan pada suhu 4 0 C Pelet DNA di cuci
Pelet dipindahkan
D. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. HASIL
Gambar 1. Sumuran gel elektroforesis
1. Estimasi konsentrasi DNA dengan metode spektrofotometer
| Kelompok | Nilai OD | Konsentrasi DNA | Sumber DNA | ||
| A260 | A280 | A260/280 | |||
| 1. 2. 3. 4. 5. 6. | 0,00 0,90 1,20 0,90 | 0,00 1,24 | | 0,00 µg/ml 4900 µg/ml 6000 µg/ml 4900 µg/ml | Hewan Hewan Hewan Tanaman Tanaman Tanaman |
Gambar 2. Visualisasi DNA dengan elektroforesis (transiluminator)
2. PEMBAHASAN
Isolasi DNA tanaman dimulai dengan mengekstraksi DNA daun bayam menggunakan nitrogen cairyang berfungsi sebagai pelisis dinding sel dan dapat mengeluarkan isi sel. Akan tetapi pada ppraktikum isolasi DNA ini tidak ditambahkan nitrogen cair, tetapi dengan penggerusan memakai mortar menggunakan larutan buffer ekstraksi, sedangkan pada hewan proses pelisisan sel dengan sabun, detergen, PBS.
Buffer ekstraksi berisi SDS dan EDTA. SDS berfungsi merusak membran dan memisahkan bagian sel yang bersifat hidrofob dan hidrofil. Dan EDTA adalh gen untuk mengikat bagian yang bersifat ion ( Na, K). Mercapethanol untuk ekstraksi ( proses untuk mendapatkan bahan dan memperoleh hasil yang diinginkan. Setelah itu proses inkbasi yang berfungsi memisahkan DNA dan bisa didapatkan hasil yang murni.
Dari inkubator eppendorf yang berisi DNA diambil dan sentrifugasi yaitu memisahkan substansi berdasarkan berat molekul. Langkah selanjutnya adalah diambil supernatannya dan dilakukan sentrifugasi lagi dan hasilnya diambil pelletnya. Diambil pelletnya karena pada waktu dimasukkan ke eppendorf, nucleus berada di luar, jadi DNA masih berada di luar (di bagian yang berat/pellet). Hasil ekstraksi DNA yang bagus ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih jika divisualisasi menggunakan image gel elektroforesis.
Metode spektrofotometri digunakan untuk mengukur jumlah asam nukleat menggunakan irradiasi UV yang diabsorbsi oleh basa yang diukur. Dan juga dapat digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian DNA dan estimasi konsentrasi DNA.
Pada percobaan yang telah dilakukan, maka didapatkan data kelas yang menunjukkan rasio A260 yang berbeda-beda. Dari data kelas maka rasio yang mendekati murni adalah kelompok 5, karena hasil yang didapatkan 1,2. Secara teoritis, sampel DNA yang murni pada rasio A260/A280 berturut-turut adalah 1,8 dan 2,0. Akan tetapi setelah visualisasi DNA dengan elektroforesis, hasilnya tidak bagus, sedangkan hasil yang terlihat bagus dan mendekati murni adalah kelompok 6. Padahal hasil spektrofometer : 0,90.
Kejadian ini disebabkan karena beberapa faktor, seperti : waktu memasukkan DNA kedalam sumuran gel elektroforesis terlalu lama. Dan akhirnya akan mempengaruhi hasilnya, faktor yang lain bisa disebabkan adanya human error, mungkin dalam pelisisan sel belum sempurna, masih terdapat kontaminan maupun protein yang lain.prosedur kerja sudah benar, karena sudah pernah dicoba dan hasilnya berhasil. Menurut Subandiyah (2006), PCR sering mengalami kegagalan karena proses denaturasi yang tidak sempurna.
Sebenarnya waktu memasukkan ke dalam sumuran tersebut juga dapat dikategorikan sebagai human error juga. Pada kelompok 6, bisa dikatakan bagus dan mendekati murni karena pada visualisasi elektroforesis terlihat basepair (pasangan basa) / hanya terlihat satu garis. Sebenarnya hasil elektroforesis tersebut bisa dimurnikan lagi dengan prosedur kerja dan teknik tertentu.
E. KESIMPULAN
Dari hasil yang telah diperoleh berdasarkan data kelas, maka yang mendekati murni adalah kelompok 6, akan tetapi masih terlihat smear DNA.
F. DAFTAR PUSTAKA
Albert, B,et al. 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka Utama
Elrod, S, Stansfield, W. 2002. Genetika Edisi Keempat. Jakarta : Erlangga
Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50.
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER
ISOLASI DNA
Disusun oleh :
Nama : Safrudin Tri Hartanto
NIM : 07640015
Kelompok : V
Asisten : Royan Arief AL, S.Si
PRODI BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN KALIJAGA
YOGYAKARTA
2009
